Vero细胞是世界卫生组织推荐为生产病毒疫苗的理想细胞基质,适宜于生物反应器的规模化培养。目前关于生物反应器无血清培养Vero细胞的研究尚少,建立以生物反应器技术为基础的规模化培养技术逐渐成为疫苗生产的主流模式。天信和（苏州）生物科技有限公司针对Vero细胞开发的无血清培养基（Cat.No：625），适用于Vero细胞的贴壁生长，可用于细胞工厂和固定床生物反应器片状载体培养，本研究主要应用天信和14L固定床生物反应器无血清培养Vero细胞，分析细胞的生长特性，为病毒生产和疫苗的制备奠定基础。

材料与方法

实 验 准 备  

实验材料：Vero细胞、片状载体

主要试剂：胰蛋白酶TrypLE Express Enzyme (1X)、柠檬酸结晶紫染液

主要仪器：天信和14L固定床生物反应器、罗氏生化分析仪、血糖仪、血球计数板、倒置显微镜

培养基：天信和625培养基（Cat.No：625） 

操 作 方 法  

1.种子细胞制备

从液氮中取1支工作种子Vero细胞冻存管，经复苏接种于T25方瓶，培养3-4天进行传代扩增，后扩增至10层细胞工厂作为生物反应器的种子细胞。

2.纸片载体预处理

称取70g片状载体，纯化水浸泡，使其完全湿润；用纯化水冲洗5分钟；转入PBS溶液中，浸泡清洗1-2次。

3.固定床生物反应器的准备

将预处理好片状载体装入组装好的14L 固定床生物反应器中，校正各电极，高压灭菌。

4.反应器预培养

高压结束后，将反应器降至室温；连接好pH、DO、加热毯、温度计探头等；排出PBS液，补加4-5L无菌625细胞培养液，润洗载体，再补加10L培养液预培养，开启生物反应器各项控制，控制温度37℃，pH7.00，搅拌50rpm，DO40%进行预培养，预培养时间24-48h。

5.固定床生物反应器细胞培养

按照初始接种密度为8.3×104cells/ cm2 的细胞浓度，接种种子细胞于生物反应器中，培养体积12L，控制温度37℃，pH7.00，搅拌50rpm，DO40%；培养24h后进行灌流培养，30L培养液进行循环灌流，灌流速度30rpm，培养4天后加大灌流速度至50rpm。

6.生物反应器取样

生物反应器培养细胞每日定时取样并用生化分析仪和血糖仪检测葡萄糖的消耗量。

7.柠檬酸结晶紫细胞计数

当细胞长至第8天时，打开罐体，从上中下各取3份0.5g（约20-21片）细胞片状载体，用结晶紫进行消化计数，取3个位置的平均细胞数，按片状载体总克数计算总细胞数。

结果与分析

1.固定床生物反应器培养Vero细胞时培养液中葡萄糖的消耗

细胞培养时葡萄糖代谢是细胞生长的主要指标，可用耗糖量反应细胞的生长状况，根据图1可知，随着培养时间的增加，培养液中葡萄糖含量不断减少，说明细胞数量不断增长，随着细胞总数接近最大值，细胞的葡萄糖消耗降低并逐渐趋于稳定。

图1：培养基含糖量趋势图

2.固定床生物反应器无血清培养Vero细胞的生长情况

用细胞工厂种子细胞接种生物反应器，接种密度为8.3×104cells/ cm2，培养8天，细胞密度达到55×104cells/ cm2，即细胞的扩增倍数约6.6倍，增殖倍数高（表1）。因此用天信和固定床生物反应器可以较好的满足Vero细胞的无血清培养。

天信和研发中心

应用生物反应器悬浮培养技术是大规模制备疫苗产品的的重要途径。

在反应器培养过程中应有足够时间的预培养，保证纸片载体表面与培养基充分接触，给细胞提供更适宜的生长环境；培养过程中，随着细胞培养时间的增加，反应器中细胞数量不断增长，培养液中的含糖量逐渐降低，根据所测培养液含糖量判断细胞生长速度，根据细胞生长速度可适时加大灌流速率，保证细胞有足够营养；本研究用天信和固定床生物反应器片状载体无血清培养Vero细胞，密度由接种8.3×104cells/ cm2增长至55×104cells/ cm2，取得了较好的效果，这为规模化生产Vero细胞相关疫苗奠定了重要的基础。